填空題克隆基因的主要目的有四個(gè):(1)();  (2)(); (3)();  (4)()。

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7.問(wèn)答題

我們實(shí)驗(yàn)室研究生做了一個(gè)如下的實(shí)驗(yàn):將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達(dá),這個(gè)pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點(diǎn),因此計(jì)劃將它從BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中進(jìn)行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過(guò)的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進(jìn)行溫育,連接后,將DNA同處理過(guò)的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了4個(gè)對(duì)照: 
對(duì)照1:將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對(duì)照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒(méi)有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過(guò))并用T4連接酶連接(但沒(méi)有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí),感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落(見(jiàn)下表1)。在第二次實(shí)驗(yàn)中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒(méi)菌落生長(zhǎng)(見(jiàn)下表1)。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn),這次得到了轉(zhuǎn)化子(見(jiàn)下表1)。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出12個(gè)菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進(jìn)行切割,其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個(gè)克隆中切出一個(gè)pdc基因,實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

第三次實(shí)驗(yàn)如何進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的挑選?并說(shuō)明其原理?
8.問(wèn)答題

我們實(shí)驗(yàn)室研究生做了一個(gè)如下的實(shí)驗(yàn):將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達(dá),這個(gè)pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點(diǎn),因此計(jì)劃將它從BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中進(jìn)行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過(guò)的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進(jìn)行溫育,連接后,將DNA同處理過(guò)的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了4個(gè)對(duì)照: 
對(duì)照1:將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對(duì)照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒(méi)有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過(guò))并用T4連接酶連接(但沒(méi)有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí),感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落(見(jiàn)下表1)。在第二次實(shí)驗(yàn)中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒(méi)菌落生長(zhǎng)(見(jiàn)下表1)。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn),這次得到了轉(zhuǎn)化子(見(jiàn)下表1)。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出12個(gè)菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進(jìn)行切割,其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個(gè)克隆中切出一個(gè)pdc基因,實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

pUC18表達(dá)的是pdc基因融合蛋白還是純pdc基因產(chǎn)物?為什么?
9.問(wèn)答題

我們實(shí)驗(yàn)室研究生做了一個(gè)如下的實(shí)驗(yàn):將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達(dá),這個(gè)pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點(diǎn),因此計(jì)劃將它從BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中進(jìn)行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過(guò)的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進(jìn)行溫育,連接后,將DNA同處理過(guò)的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了4個(gè)對(duì)照: 
對(duì)照1:將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對(duì)照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒(méi)有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過(guò))并用T4連接酶連接(但沒(méi)有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí),感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落(見(jiàn)下表1)。在第二次實(shí)驗(yàn)中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒(méi)菌落生長(zhǎng)(見(jiàn)下表1)。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn),這次得到了轉(zhuǎn)化子(見(jiàn)下表1)。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出12個(gè)菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進(jìn)行切割,其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個(gè)克隆中切出一個(gè)pdc基因,實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

為什么要用堿性磷酸酶處理載體?
10.問(wèn)答題

我們實(shí)驗(yàn)室研究生做了一個(gè)如下的實(shí)驗(yàn):將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達(dá),這個(gè)pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點(diǎn),因此計(jì)劃將它從BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中進(jìn)行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過(guò)的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進(jìn)行溫育,連接后,將DNA同處理過(guò)的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了4個(gè)對(duì)照: 
對(duì)照1:將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對(duì)照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒(méi)有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過(guò))并用T4連接酶連接(但沒(méi)有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí),感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落(見(jiàn)下表1)。在第二次實(shí)驗(yàn)中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒(méi)菌落生長(zhǎng)(見(jiàn)下表1)。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn),這次得到了轉(zhuǎn)化子(見(jiàn)下表1)。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出12個(gè)菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進(jìn)行切割,其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個(gè)克隆中切出一個(gè)pdc基因,實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

對(duì)照3和4各有什么作用?