我們實驗室研究生做了一個如下的實驗:將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達(dá),這個pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點,因此計劃將它從BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格按分子克隆實驗手冊中進(jìn)行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進(jìn)行溫育,連接后,將DNA同處理過的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。
實驗中同時設(shè)置了4個對照:
對照1:將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。
對照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。
對照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。
在進(jìn)行第一次實驗時,感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(見下表1)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒菌落生長(見下表1)。接著又進(jìn)行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(見下表1)。從實驗平板上挑出12個菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進(jìn)行切割,其中9個克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個克隆中切出一個pdc基因,實驗終于獲得成功。
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