問答題一種基因產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)的原因分析。

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4.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點，因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格地按照克隆手冊中的方法進行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照： 
對照1：   將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過）并用 DNA連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細
菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進行第一次實驗時，感受態(tài)細胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長（表 2）。接著又進行了第三次實驗，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實驗平板上挑出 12 個菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進行切割，其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個cDNA 片段，實驗終于獲得成功。

為什么要用堿性磷酸酶處理載體？
5.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點，因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格地按照克隆手冊中的方法進行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照： 
對照1：   將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過）并用 DNA連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細
菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進行第一次實驗時，感受態(tài)細胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長（表 2）。接著又進行了第三次實驗，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實驗平板上挑出 12 個菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進行切割，其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個cDNA 片段，實驗終于獲得成功。

對照3 和4 各有什么作用？
6.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點，因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格地按照克隆手冊中的方法進行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照： 
對照1：   將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過）并用 DNA連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細
菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進行第一次實驗時，感受態(tài)細胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長（表 2）。接著又進行了第三次實驗，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實驗平板上挑出 12 個菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進行切割，其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個cDNA 片段，實驗終于獲得成功。

影響第二次實驗結(jié)果的原因是什么？對照2 的作用何在？
7.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點，因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格地按照克隆手冊中的方法進行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照： 
對照1：   將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過）并用 DNA連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細
菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進行第一次實驗時，感受態(tài)細胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長（表 2）。接著又進行了第三次實驗，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實驗平板上挑出 12 個菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進行切割，其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個cDNA 片段，實驗終于獲得成功。

你如何看待第一次的實驗結(jié)果？對照 1 的目的是什么？
10.問答題λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進行獨立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來，以便進行進一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個切點的限制性內(nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個有 4×10 個克隆的 cDNA 文庫。說明怎樣處理載體和 cDNA 分子，才能把它們連接到一起。處理過的載體本身能自連嗎？cDNA呢？