問答題DNA轉(zhuǎn)錄與復制有哪些差別?

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6.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達載體,以便在 E.coli 中大量制備相應的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點,因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴格地按照克隆手冊中的方法進行:載體用 BamHI切割以后,立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸;接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA連接酶后進行溫育,連接之后,將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后,將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因,所以,轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照: 
對照1:   將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;       
對照2:   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;  
對照3:   將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;  
對照4:   將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用 DNA連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細
菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進行第一次實驗時,感受態(tài)細胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(表 2)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細胞,但這一次,所有的平板上都沒有菌落生長(表 2)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(表 2)。從實驗平板上挑出 12 個菌落,分離了質(zhì)粒 DNA,并用 BamHI進行切割,其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶,另三個克隆中切出一個cDNA 片段,實驗終于獲得成功。

為什么要用堿性磷酸酶處理載體?
7.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達載體,以便在 E.coli 中大量制備相應的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點,因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴格地按照克隆手冊中的方法進行:載體用 BamHI切割以后,立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸;接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA連接酶后進行溫育,連接之后,將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后,將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因,所以,轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照: 
對照1:   將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;       
對照2:   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;  
對照3:   將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;  
對照4:   將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用 DNA連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細
菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進行第一次實驗時,感受態(tài)細胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(表 2)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細胞,但這一次,所有的平板上都沒有菌落生長(表 2)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(表 2)。從實驗平板上挑出 12 個菌落,分離了質(zhì)粒 DNA,并用 BamHI進行切割,其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶,另三個克隆中切出一個cDNA 片段,實驗終于獲得成功。

對照3 和4 各有什么作用?
8.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達載體,以便在 E.coli 中大量制備相應的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點,因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴格地按照克隆手冊中的方法進行:載體用 BamHI切割以后,立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸;接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA連接酶后進行溫育,連接之后,將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后,將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因,所以,轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照: 
對照1:   將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;       
對照2:   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;  
對照3:   將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;  
對照4:   將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用 DNA連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細
菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進行第一次實驗時,感受態(tài)細胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(表 2)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細胞,但這一次,所有的平板上都沒有菌落生長(表 2)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(表 2)。從實驗平板上挑出 12 個菌落,分離了質(zhì)粒 DNA,并用 BamHI進行切割,其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶,另三個克隆中切出一個cDNA 片段,實驗終于獲得成功。

影響第二次實驗結(jié)果的原因是什么?對照2 的作用何在?
9.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達載體,以便在 E.coli 中大量制備相應的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點,因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴格地按照克隆手冊中的方法進行:載體用 BamHI切割以后,立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸;接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA連接酶后進行溫育,連接之后,將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后,將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因,所以,轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照: 
對照1:   將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;       
對照2:   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;  
對照3:   將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上;  
對照4:   將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用 DNA連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細
菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進行第一次實驗時,感受態(tài)細胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(表 2)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細胞,但這一次,所有的平板上都沒有菌落生長(表 2)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(表 2)。從實驗平板上挑出 12 個菌落,分離了質(zhì)粒 DNA,并用 BamHI進行切割,其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶,另三個克隆中切出一個cDNA 片段,實驗終于獲得成功。

你如何看待第一次的實驗結(jié)果?對照 1 的目的是什么?