打算將一個(gè) cDNA 克隆到一個(gè)表達(dá)載體,以便在 E.coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點(diǎn),因此計(jì)劃將它從 BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊(cè)中的方法進(jìn)行:載體用 BamHI切割以后,立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸;接著將處理過(guò)的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育,連接之后,將 DNA 同已處理過(guò)的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后,將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因,所以,轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了 4 個(gè)對(duì)照:
對(duì)照1: 將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上;
對(duì)照2: 將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上;
對(duì)照3: 將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒(méi)有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上;
對(duì)照4: 將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過(guò))并用 DNA連接酶連接(但沒(méi)有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。
在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí),感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落(表 2)。在第二次實(shí)驗(yàn)中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)(表 2)。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn),這次得到了轉(zhuǎn)化子(表 2)。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出 12 個(gè)菌落,分離了質(zhì)粒 DNA,并用 BamHI進(jìn)行切割,其中 9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶,另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA 片段,實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。
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