問(wèn)答題

打算將一個(gè) cDNA 克隆到一個(gè)表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從 BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊(cè)中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過(guò)的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過(guò)的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了 4 個(gè)對(duì)照： 
對(duì)照1：   將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對(duì)照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過(guò)）并用 DNA連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出 12 個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA 片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

影響第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是什么？對(duì)照2 的作用何在？

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你可能感興趣的試題

1.問(wèn)答題

打算將一個(gè) cDNA 克隆到一個(gè)表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從 BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊(cè)中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過(guò)的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過(guò)的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了 4 個(gè)對(duì)照： 
對(duì)照1：   將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對(duì)照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過(guò)）并用 DNA連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出 12 個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA 片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

你如何看待第一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果？對(duì)照 1 的目的是什么？
2.問(wèn)答題λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個(gè)在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來(lái)的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來(lái)，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個(gè)切點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來(lái)，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個(gè)有 4×10 個(gè)克隆的 cDNA 文庫(kù)。能夠用XhoI從重組質(zhì)粒中切出cDNA 嗎？
3.問(wèn)答題λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個(gè)在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來(lái)的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來(lái)，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個(gè)切點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來(lái)，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個(gè)有 4×10 個(gè)克隆的 cDNA 文庫(kù)。載體和cDNA分子要經(jīng)過(guò)怎樣的處理才能提高產(chǎn)生重組 DNA分子的效率？
4.問(wèn)答題λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個(gè)在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來(lái)的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來(lái)，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個(gè)切點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來(lái)，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個(gè)有 4×10 個(gè)克隆的 cDNA 文庫(kù)。說(shuō)明怎樣處理載體和 cDNA 分子，才能把它們連接到一起。處理過(guò)的載體本身能自連嗎？cDNA呢？
5.問(wèn)答題

λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個(gè)在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來(lái)的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來(lái)，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個(gè)切點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來(lái)，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個(gè)有 4×10 個(gè)克隆的 cDNA 文庫(kù)。

在此過(guò)程中，載體分子轉(zhuǎn)變成重組體的頻率是多少（每對(duì)核苷酸的平均分子量 660Da）？
6.問(wèn)答題λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個(gè)在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來(lái)的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來(lái)，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個(gè)切點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來(lái)，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個(gè)有 4×10 個(gè)克隆的 cDNA 文庫(kù)。假定載體長(zhǎng)為 43kb，cDNA 的平均長(zhǎng)度是 lkb，請(qǐng)估計(jì)在連接混合物中，載體分子同cDNA 的比例是多少？
7.問(wèn)答題

X染色體的失活是一種獨(dú)特的發(fā)育調(diào)控機(jī)制，它關(guān)閉了整個(gè)染色體上的所有基因的表達(dá)。在人類(lèi) X 染色體中，失活作用涉及到 1.5×108 以上的堿基對(duì)和幾千個(gè)基因。在女性中，兩條X染色體中的任何一條失活所造成的X連鎖基因的表達(dá)與正常男性單個(gè)X染色體上基因表達(dá)的結(jié)果是相同的。雖然失活的機(jī)理仍不了解，一般認(rèn)為失活作用是在染色體的特定區(qū)域即 X 失活中心開(kāi)始的，然后擴(kuò)散到染色體的其他部分。雖然失活染色體上的大多數(shù)基因被關(guān)閉了，但少數(shù)仍有活性，因此，可以推測(cè) X 的失活作用與 X 連鎖基因的表達(dá)模式有關(guān)。為了驗(yàn)證這種推測(cè)，分離了大量的人的 X 染色體基因的 cDNA 并用 Northern 印跡法檢查它們的表達(dá)。比較了這些基因在 X 染色體正常的男性和女性細(xì)胞中的表達(dá)、在 X 染色體異常的男性和女性個(gè)體中的表達(dá)、以及在嚙齒動(dòng)物：人細(xì)胞雜交株中的表達(dá)，這種雜交株保留了一個(gè)失活的人的 X染色體（Xi）或是一個(gè)有活性的人 X染色體（Xa）。在四種 cDNA 中，發(fā)現(xiàn)了三種表達(dá)模式，A、B、C 三種 cDNA示于圖 4。

指出每一種表達(dá)模式中表達(dá)的基因是來(lái)自于活性染色體、非活性染色體，還是二者都有。哪一種是最普遍的，哪一種是最特殊的？
8.問(wèn)答題

四膜蟲(chóng)是一種雙核有纖毛的原生動(dòng)物。小核（微核）含有細(xì)胞染色體的主要拷貝，它參與細(xì)胞的性接合，而并不在通常的基因表達(dá)中起作用。大核（巨核）含有細(xì)胞基因組的“工作”拷貝，由大量基因大小的雙鏈 DNA 片段（微染色體）組成，它們活躍地進(jìn)行著轉(zhuǎn)錄。含有核糖體 RNA基因的微染色體拷貝數(shù)很多，可以用梯度離心進(jìn)行分離。在電子顯微鏡下檢查，每一個(gè)核糖體微染色體是一種長(zhǎng)為 21kb 的線(xiàn)性結(jié)構(gòu)。進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，核糖體微染色體的遷移也是 21kb（圖 3 的第一泳道）。但是，如果用限制性?xún)?nèi)切核酸酶BglⅡ切割微染色體，產(chǎn)生的兩個(gè)片段（13.4kb 和 3.8kb）的總和不等于 21kb（圖3的第二泳道），改用其他的限制性?xún)?nèi)切核酸酶切割，所產(chǎn)生的限制性片段的總和也都小于 21kb，并且不同種酶切割產(chǎn)生的片段總和都不一樣。如果把未經(jīng)切割的微染色體先進(jìn)行變性和復(fù)性處理，然后再進(jìn)行凝膠電泳，所得到的雙鏈 DNA片段只有 10．5kb（圖 3 第三泳道）；與此相似的是，將 BglⅡ切割的微染色體進(jìn)行變性和復(fù)性，電泳后，13．4kb的片段被 6．7kb 的片段所取代 （圖 3 第四泳道）。請(qǐng)解釋為什么限制性片段的總長(zhǎng)度不等于 21kb？為什么變性和復(fù)性之后電泳的結(jié)果有所改變？對(duì)于核糖體微染色體中的總序列組成你有什么看法？