問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點，因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格地按照克隆手冊中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照： 
對照1：   將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過）并用 DNA連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實驗時，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實驗，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實驗平板上挑出 12 個菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個cDNA 片段，實驗終于獲得成功。

對照3 和4 各有什么作用？

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1.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點，因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格地按照克隆手冊中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照： 
對照1：   將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過）并用 DNA連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實驗時，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實驗，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實驗平板上挑出 12 個菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個cDNA 片段，實驗終于獲得成功。

影響第二次實驗結(jié)果的原因是什么？對照2 的作用何在？
2.問答題

打算將一個 cDNA 克隆到一個表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點，因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格地按照克隆手冊中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照： 
對照1：   將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過）并用 DNA連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實驗時，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實驗，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實驗平板上挑出 12 個菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個cDNA 片段，實驗終于獲得成功。

你如何看待第一次的實驗結(jié)果？對照 1 的目的是什么？
4.問答題λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個切點的限制性內(nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個有 4×10 個克隆的 cDNA 文庫。載體和cDNA分子要經(jīng)過怎樣的處理才能提高產(chǎn)生重組 DNA分子的效率？
5.問答題λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個切點的限制性內(nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個有 4×10 個克隆的 cDNA 文庫。說明怎樣處理載體和 cDNA 分子，才能把它們連接到一起。處理過的載體本身能自連嗎？cDNA呢？
6.問答題

λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個切點的限制性內(nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個有 4×10 個克隆的 cDNA 文庫。

在此過程中，載體分子轉(zhuǎn)變成重組體的頻率是多少（每對核苷酸的平均分子量 660Da）？
7.問答題λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個切點的限制性內(nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個有 4×10 個克隆的 cDNA 文庫。假定載體長為 43kb，cDNA 的平均長度是 lkb，請估計在連接混合物中，載體分子同cDNA 的比例是多少？
8.問答題

X染色體的失活是一種獨特的發(fā)育調(diào)控機制，它關(guān)閉了整個染色體上的所有基因的表達(dá)。在人類 X 染色體中，失活作用涉及到 1.5×108 以上的堿基對和幾千個基因。在女性中，兩條X染色體中的任何一條失活所造成的X連鎖基因的表達(dá)與正常男性單個X染色體上基因表達(dá)的結(jié)果是相同的。雖然失活的機理仍不了解，一般認(rèn)為失活作用是在染色體的特定區(qū)域即 X 失活中心開始的，然后擴(kuò)散到染色體的其他部分。雖然失活染色體上的大多數(shù)基因被關(guān)閉了，但少數(shù)仍有活性，因此，可以推測 X 的失活作用與 X 連鎖基因的表達(dá)模式有關(guān)。為了驗證這種推測，分離了大量的人的 X 染色體基因的 cDNA 并用 Northern 印跡法檢查它們的表達(dá)。比較了這些基因在 X 染色體正常的男性和女性細(xì)胞中的表達(dá)、在 X 染色體異常的男性和女性個體中的表達(dá)、以及在嚙齒動物：人細(xì)胞雜交株中的表達(dá)，這種雜交株保留了一個失活的人的 X染色體（Xi）或是一個有活性的人 X染色體（Xa）。在四種 cDNA 中，發(fā)現(xiàn)了三種表達(dá)模式，A、B、C 三種 cDNA示于圖 4。

指出每一種表達(dá)模式中表達(dá)的基因是來自于活性染色體、非活性染色體，還是二者都有。哪一種是最普遍的，哪一種是最特殊的？
9.問答題

四膜蟲是一種雙核有纖毛的原生動物。小核（微核）含有細(xì)胞染色體的主要拷貝，它參與細(xì)胞的性接合，而并不在通常的基因表達(dá)中起作用。大核（巨核）含有細(xì)胞基因組的“工作”拷貝，由大量基因大小的雙鏈 DNA 片段（微染色體）組成，它們活躍地進(jìn)行著轉(zhuǎn)錄。含有核糖體 RNA基因的微染色體拷貝數(shù)很多，可以用梯度離心進(jìn)行分離。在電子顯微鏡下檢查，每一個核糖體微染色體是一種長為 21kb 的線性結(jié)構(gòu)。進(jìn)行凝膠電泳時，核糖體微染色體的遷移也是 21kb（圖 3 的第一泳道）。但是，如果用限制性內(nèi)切核酸酶BglⅡ切割微染色體，產(chǎn)生的兩個片段（13.4kb 和 3.8kb）的總和不等于 21kb（圖3的第二泳道），改用其他的限制性內(nèi)切核酸酶切割，所產(chǎn)生的限制性片段的總和也都小于 21kb，并且不同種酶切割產(chǎn)生的片段總和都不一樣。如果把未經(jīng)切割的微染色體先進(jìn)行變性和復(fù)性處理，然后再進(jìn)行凝膠電泳，所得到的雙鏈 DNA片段只有 10．5kb（圖 3 第三泳道）；與此相似的是，將 BglⅡ切割的微染色體進(jìn)行變性和復(fù)性，電泳后，13．4kb的片段被 6．7kb 的片段所取代 （圖 3 第四泳道）。請解釋為什么限制性片段的總長度不等于 21kb？為什么變性和復(fù)性之后電泳的結(jié)果有所改變？對于核糖體微染色體中的總序列組成你有什么看法？